Сравнительная характеристика условий выделения моноцитов методом адгезии для экспериментов in vitro

Введение. Моноциты и макрофаги – клетки, играющие важнейшую роль в работе системы врожденного иммунитета, также могут быть вовлечены в патологический процесс при различных заболеваниях. По этой причине исследование функциональной активности данных клеток in vitro представляет большой научный интерес. Литературные данные указывают на большое разнообразие методов, используемых для выделения культуры первичных моноцитов, но применяемые подходы часто оказываются противоречивыми.
Цель. Провести сравнительный анализ влияния различных условий на эффективность адгезии моноцитов для определения наиболее оптимального сочетания факторов, обеспечивающих наибольший выход и чистоту получаемых клеток.
Материалы и методы. Периферическую венозную кровь получали от 6 здоровых добровольцев. Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли стандартным методом центрифугирования на градиенте плотности фиколла (1,077 г/мл). После центрифугирования МПК помещали в лунки 24-луночного планшета, покрытые коллагеном либо без покрытия, и инкубировали в течение 2 или 24 часов в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональную телячью (FCS) или собственную сыворотку донора (AHS). Число прикрепившихся моноцитов оценивали методом эпифлуоресцентной микроскопии после окраски Hoechst 33342 с автоматическим подсчетом ядер в десяти полях зрения.
Результаты. Установлено, что инкубация клеток в течение 2 часов в лунках без покрытия в присутствии 10% FCS позволяет получать наибольшее количество моноцитов с чистотой 80,9 (66,5- 89,1)%. Число моноцитов, полученных адгезией в коллагенированных лунках имело тенденцию быть ниже, независимо от типа используемой сыворотки. В нашем эксперименте способность моноцитов к адгезии существенно снижалась при использовании комбинации непокрытого пластика и 10% AHS. Пролонгированное до 24 часов время инкубации сопровождалось значимым снижением числа прикрепившихся моноцитов в большинстве случаев.
Заключение. Инкубация МПК в течение 2 часов на культуральном пластике без покрытия в присутствии 10% FCS обеспечивает наибольший выход и чистоту получаемых моноцитов по сравнению с другими протестированными условиями.

моноциты, макрофаги, адгезия, воспаление

1. Murray P.J., Wynn T.A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets // Nat. Rev. Immunol. 2011. Vol.11, №11. P.723–737. doi: 10.1038/nri3073

2. Bikash T., Keunwook L. Metabolic influence on macrophage polarization and pathogenesis // BMB Rep. 2019. Vol.52, №6. P.360–372. doi: 10.5483/BMBRep.2019.52.6.140

3. Tarique A.A., Logan J., Thomas E., Holt P.G., Sly P.D., Fantino E. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2015. Vol.53, №5. P.676–88. doi: 10.1165/rcmb.2015-0012OC

4. Böyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1968. Vol.97. P.77–89.

5. Grievink H.W., Luisman T., Kluft C., Moerland M., Malone K.E. Comparison of Three Isolation Techniques for Human Peripheral Blood Mononuclear Cells: Cell Recovery and Viability, Population Composition, and Cell Functionality // Biopreserv. Biobank. 2016. Vol.14, №5. P.410–415. doi: 10.1089/bio.2015.0104

6. Nielsen M.C., Andersen M.N., Møller H.J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro // Immunology. 2020. Vol.159, №1. P.63–74. doi: 10.1111/imm.13125

7. Meital L.T., Coward A.S., Windsor M.T., Bailey T.G., Kuballa A., Russell F.D. A simple and effective method for the isolation and culture of human monocytes from small volumes of peripheral blood // J. Immunol. Methods. 2019. Vol.472. P.75–78. doi: 10.1016/j.jim.2019.04.005

8. Treves A.J., Yagoda D., Haimovitz A., Ramu N., Rachmilewitz D., Fuks Z. The isolation and purification of human peripheral blood monocytes in cell suspension // J. Immunol. Methods. 1980. Vol.39, №1-2. P.71–80. doi: 10.1016/0022-1759(80)90295-1

9. Saghaeian-Jazi M., Mohammadi S., Sedight S. Culture and Differentiation of Monocyte Derived Macrophages Using Human Serum: An Optimized Method // Zahedan J. Res. Med. Sci. 2016. Vol.18, №6. P.e7362. doi: 10.17795/zjrms-7362.

10. Schmidt D., Joyce E.J., Kao W.J. Fetal bovine serum xenoproteins modulate human monocyte adhesion and protein release on biomaterials in vitro // Acta Biomater. 2011. Vol.7, №2. P.515–525. doi: 10.1016/j.actbio.2010.08.022

11. Look N. Heat inactivation – are you wasting your time? // Art to Science (HyClone Newsletter). 1996. Vol.15. P.1–5.

12. Koyama Y., Norose-Toyoda K., Hirano S., Kobayashi M., Ebihara T., Someki I., Fujisaki H., Irie S. Type I collagen is a non-adhesive extracellular matrix for macrophages // Arch. Histol. Cytol. 2000. Vol.63, №1. P.71–79. doi: 10.1679/aohc.63.71

13. Garnotel R., Rittié L., Poitevin S., Monboisse J.C., Nguyen P., Potron G., Maquart F.X., Randoux A., Gillery P. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95) // J. Immunol. 2000. Vol.164, №11. P.5928–5934. doi: 10.4049/jimmunol.164.11.5928

14. Khalaji S., Zondler L., KleinJan F., Nolte U., Mulaw M.A., Danzer K.M., Weishaupt J.H., Gottschalk K.E. Age Increases Monocyte Adhesion on Collagen // Sci. Rep. 2017. Vol.7. P.46532. doi: 10.1038/srep46532